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NGS mRNA建庫完全攻略—從mRNA純化到注意事項

 

mRNA測序簡述

RNA高通量測序(RNA-sequencing,縮寫為RNA-seq)是目前高通量測序技術中應用最廣泛的技術之一,它可以幫助我們了解各種比較條件下基因表達情況的差異。在所有差異類型的檢測中,最常見的就是檢測mRNA表達量的差異,而mRNA樣本在上機測序之前會做怎麼的處理?它與DNA樣本的建庫處理又有哪些不同?這些伱們都清楚了嗎?今天小翊跟大家講解的就是這部分内容。

mRNA建庫步驟

在上機測序之前,提取到的核酸樣本都需要做處理,樣本處理的過程就叫做建庫,我們都知道DNA建庫的本質是在核酸片段兩端加上接頭的過程,RNA建庫的本質也是如此。關于DNA文庫構建,詳見DNA建庫方法完全解析(超鍊接https://mp.weixin.qq.com/s/Mz_3OTTjbwgBUSjj8q_hzg)一文,而RNA建庫由于增加了RNA富集、片段化和反轉成雙鍊DNA幾個步驟顯得比DNA文庫構建要繁瑣些,下面我們一起看看 mRNA建庫中的三個關鍵步驟:mRNA純化、片段化處理和反轉成雙鍊DNA。

1.mRNA純化

首先說到mRNA純化,為什麼要做mRNA純化呢,這是因為通常抽提到的總RNA中,絕大部分都是核糖體RNA(rRNA),如圖1所示。

圖片2.png 

1.人類組織或細胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖:核糖體RNA占90%以上,mRNA占2%~3%,剩下的為LncRNA、tRNA、miRNA等

如果我們把所有的RNA都拿來測序,測到的絕大部分的數據都是rRNA,而rRNA在不同組織、器官當中的表達極度穩定,也就是說,這樣的數據,并不能為實驗者提供有用的信息,所以在很多的轉錄組測序實驗中都選擇純化mRNA的方法來提高最終測序數據利用率。

  那麼,該怎樣從總的RNA中,單獨将我們想要的mRNA純化出來呢 ???

mRNA純化的方法主要包括兩種:poly(A)純化法和去除rRNA法

1)poly(A)純化法

Poly(A)純化法主要應用在真核生物的mRNA純化,大部分真核生物的mRNA結構與原核生物的mRNA結構有明顯區别,真核生物的mRNA的3’端具有poly(A)尾結構,因此可以選用Oligo(dT)磁珠直接進行靶向雜交富集(見圖2);當然,也可以通過使用Oligo(dT)引物進行反轉錄以擴增捕獲帶有poly(A)的mRNA,但是引物捕獲由于特異性差和富集度低,因此在實際操作中還是以磁珠純化的方法較多。

圖片3.png 

2. 利用Oligo(dT)磁珠特異性吸附真核生物mRNA示意圖

注意:利用Oligo dT磁珠對mRNA進行富集和純化時,在移除上清時要等磁珠被徹底吸附後(上清澄清)在磁力架上小心進行,避免吸到磁珠,以免造成mRNA的損失。加入片段化試劑前,要将Bead Washing Buffer吸幹淨,否則會影響片段化結果,可以在用大規格槍移除液體之後再用10 uL的移液槍移除殘留的Washing Buffer(或者直接用200 uL的黃槍頭套着10 uL的白槍頭使用)

2)去除rRNA法

針對類似原核生物中沒有poly(A)結構的mRNA和部分樣品降解的總RNA樣本(如FFPE樣本),無法直接富集,隻能通過去除rRNA的方法來達到富集mRNA的目的。

目前所涉及的去除rRNA方法主要如下:

1)rRNA消減雜交法:通過使用與 rRNA 互補的寡核苷酸探針與總 RNA 樣品雜交去除 16S 和 23S rRNA;相應的試劑盒有MICROBExpress bacterial mRNA enrichment kit (Ambion),RiboMinus bacteria transcriptome isolation kit (Invitrogen) 和Ribo-Zero rRNA removal kit (Epicentre);

圖片4.png 

3. rRNA消減雜交法原理圖

2)5′單核苷酸依賴的外切酶處理法:相應的試劑盒有mRNA-ONLY prokaryotic mRNA isolation kit (Epicentre開發)等;

圖片5.png 

4. 5′單核苷酸依賴的外切酶處理法原理圖

3)選擇性引物擴增法:通過預先設計一系列的具有非 rRNA 偏好性的 NSR 引物, 然後使用這些 NSR 引物選擇性擴增 rRNA 以外的轉錄本。相應試劑盒有Ovation prokaryotic RNA-seq system (NuGEN)等;

圖片6.png 

5. 選擇性引物擴增法原理圖

4)免疫共沉澱法:與 RNA 結合蛋白 Hfq 等免疫共沉澱法由于 Hfq 能夠高效地結合 sRNA, 并能輔助它們與靶标 mRNA 結合, 因此常用于 sRNA 及其靶标 mRNA 的研究。

圖片7.png 

6. Hfq等免疫共沉澱法原理圖

5)依賴于雙鍊特異核酸酶的cDNA均一化法:這種方法從真核生物借鑒而來, 是在 cDNA 水平上降低 rDNA 和 tDNA 所占的比例, 在原核生物中應用的還不多。相應的試劑盒主要有trimmer-direct cDNA normalization kit(Evrogen);

6)大腸杆菌 poly(A)聚合酶加尾法:通過使用可以選擇性地對 mRNA 加尾的細菌poly(A)聚合酶來相對偏好性地獲取 mRNA, 但與前幾種方法相比, 這種方法去除 rRNA的效率較低, 常結合其他方法一起使用;相應的試劑盒有MessageAmp II-bacteria kit (Ambion)。

2.片段化處理

mRNA純化之後的文庫構建通常有兩種思路,一種是先用oligo(dT)引物反轉錄mRNA,再進行cDNA的片段化,另外一種則是先将mRNA打斷,再結合随機引物進行反轉錄。

1)先用oligo(dT)引物反轉錄mRNA,再進行cDNA的片段化:此方法先得到長片段的cDNA,反轉成雙鍊cDNA之後再利用DNA片段化的方法進行片段化(酶切法或機械法),得到片段化dsDNA之後的建庫方法與DNA建庫方法完全一緻。

2)先将mRNA打斷,再結合随機引物進行反轉錄:此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子(Mg2+、Zn2+)溶液處理法、酶(RNaseIII)處理法,mRNA片段化之後應立即進行一鍊cDNA合成,因為mRNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子(Mg2+、Zn2+)溶液處理法打斷時需根據需要的文庫片段大小選擇合适的打斷溫度和時間。(一般設置為150-200bp  94°C,15 min; 200-300bp 94°C,10 min; 250-550 bp 94°C,5 min)

兩種片段化結果,對後期的轉錄本有不同的偏好性,對應數據可參考下圖:

圖片8.png 

7.不同方法建庫對後期讀數的偏好性,紅線代表RNA片段化,綠線代表反轉為cDNA後片段化

先針對mRNA進行打斷再進行反轉錄獲得測序reads主要是針對基因本體的;若先反轉錄,尤其是結合oligo(dT)進行反轉錄獲得的測reads對轉錄本3'端具有比較強的偏好性,所以在mRNA-Seq中建議采用先對mRNA打斷再進行反轉錄的文庫構建方法。

3.反轉成雙鍊cDNA

在做mRNA測序文庫構建的時候,一般分為常規建庫和mRNA鍊特異性建庫。鍊特異性文庫和常規mRNA文庫最大的區别在于合成第二鍊cDNA時加入的核苷酸種類,如果要構建常規mRNA文庫,則加入dNTP,而如果要構建鍊特異性mRNA文庫則加入dNTP中使用dUTP代替dTTP,這樣合成的第二鍊cDNA含有U堿基,後期再通過識别U堿基的方法去除第二鍊cDNA,從而達到構建鍊特異性mRNA的效果,具體方法包括:使用特殊酶不擴增帶有U堿基的鍊;使用UDG酶去除帶有U堿基的合成鍊。關于鍊特異性mRNA和常規mRNA文庫構建的區别可參考:為什麼要建mRNA鍊特異性文庫?(超鍊接https://mp.weixin.qq.com/s/ETkOnqMhNxOwb3TJ45R1EA)一文。

注意事項

小翊總結了mRNA建庫中的幾個小Tips,希望大家在mRNA建庫的時候可以少走一些彎路:

Tip1:mRNA建庫方法對RNA的完整度有較高的要求。也就是說,隻有在mRNA大部分是完整的狀态下,才能得到比較好的效果。

Tip2:尤其是選擇磁珠吸附的方法,我們知道磁珠它所吸附的是Poly(A)的那些序列。那麼如果mRNA發生了降解,也就是mRNA斷掉了,那麼磁珠所吸附下來的片段,都是那些靠近3'端的那些斷片,而那些5'端的斷片呢,是吸附不下來的。會在富集過程中被洗脫掉,如圖8所示,那麼,接下來的數據分析當中,就會發生一定的數據偏差。

圖片9.png 

8. 磁珠吸附正常的mRNA和磁珠吸附降解的mRNA示意圖

如何保證能夠測到盡可能完整的mRNA序列呢?

我們引用Illumina的實驗建議:建庫之前先對總RNA進行一次質量檢測,一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛細管電泳儀,對總RNA樣本進行一次電泳質檢。Bioanalyzer會根據18S和28S這兩個核糖體RNA的電泳峰是否高、是否尖,來判斷RNA的質量,并且會給出一個分值。這兩個峰越高、越尖,也就說明RNA的降解就越少,完整度就越高。相對應的分值也會越高。反之,打分就會低。這個分值就是我們常說的“RIN”值。RIN值最高是10分,最低是0分。推薦大家使用RIN值在8.0以上的RNA進行建庫和測序。

 

以上就是小翊為大家解析的mRNA建庫的關鍵步驟,此外,小翊還專程為大家繪制了一幅mRNA建庫的标準流程圖,希望可以幫助大家對建庫的整套流程有更好的認識。

圖片10.png 

9. mRNA建庫流程圖

參考文獻

1.Westermann AJ, Gorski SA, Vogel J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol, 2012, 10(9): 618–

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2.Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity. Nat Rev Genet, 2009, 11(1): 9–16.

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5.Ottesen EA, Young CR, Eppley JM, Ryan JP, Chavez FP, Scholin CA, DeLong EF. Pattern and synchrony of gene expression among sympatric marine microbial populations. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(6): E488–E497.