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劃重點!NGS中DNA建庫方法全面解析

高通量測序技術的飛速發展,測序通量大幅增加,要求上遊樣本處理盡可能簡單快速,以提高NGS整個流程的工作效率。文庫構建,尤其是DNA文庫構建是二代測序建庫技術的基礎,其他的建庫方法都以該方法為基礎發展而來。DNA建庫方法是分子生物學的實驗原理,其本質就是在待測片段兩端加上接頭的過程,目前DNA建庫方法按照接頭連接方式不同可分為五類:

 TA克隆連接接頭建庫

 Swift法建庫

 轉座酶法建庫

 PCR擴增子建庫

平末端連接接頭建庫


TA克隆連接接頭建庫


TA克隆連接接頭建庫是目前應用最廣泛的建庫技術,簡單描述就是:将提取好的DNA片段化,在進行末端修複和加A尾,然後連接上接頭(adapter),最後通過PCR擴增(可選),中間再穿插着純化/分選步驟就完成了文庫的構建。在這裡,提前合成好的帶T尾接頭和末端帶A的目的片段在DNA連接酶的作用下通過TA克隆方式連接(圖1)。


圖1. TA克隆連接接頭建庫法流程圖

TA克隆連接接頭可以有效保留樣本幾乎所有基因組信息,非常有利于未知拷貝數的和基因組變異的檢測,是全基因組測序和外顯子測序的主要建庫手段,目前市面上有很多試劑盒供應,直接應用試劑盒建庫,操作簡單,2.5-3.5h就可獲得穩定高品質文庫。

Swift法建庫


Swift建庫方案是Swift BioSciences公司獨有的NGS建庫技術,基本步驟與TA克隆連接接頭建庫方法類似,是由TA克隆連接接頭的方法發展而來。主要通過兩步法在插入片段兩端引入P5和P7接頭序列,末端修複之後,先在3,端連接帶P7的接頭,再在5,端連接帶P5的接頭,最後通過PCR擴增(可選)完成文庫構建(見圖3)。Swift法建庫主要宣傳優勢是文庫轉化效率高,特别是針對cfDNA樣本的建庫實驗。但此方法操作比較繁瑣,新手很難達到其官方宣傳的建庫效率。

圖2. Swift法建庫流程圖

轉座酶法建庫

轉座酶法建庫技術的核心是Tn5轉座子,Tn5轉座子是一段含有若幹抗性基因和編輯轉座酶基因的DNA片段,是一種細菌轉座子,最早在大腸杆菌中發現。NGS文庫構建即把DNA樣本片段化或篩分成指定長度的目标序列,再加上寡核苷酸接頭P5、P7(和條形碼Barcode),用于後續測序上機。傳統建庫方式需經過DNA片段化、末端修複、接頭連接、文庫擴增、多次純化分選等步驟,耗時較長,将Tn5用于測序文庫構建時,可将DNA片段化、末端修複、接頭連接等多步反應轉變為1步反應,極大縮短建庫時間,提高工作效率。

Tn5用于NGS建庫的體外轉座要素包含:轉座子的末端序列、靶DNA、轉座酶(Tnp)和Mg2+(激活劑),轉座法建庫形成的文庫結構如下:

圖3. 轉座法建庫文庫結構

将P5、P7端部分接頭序列(Adapter 1/2)+轉座子末端序列設計合成供體DNA,Tnp識别轉座子末端形成帶有P5、P7端部分接頭的Tn5轉座複合體(見下圖4)。該複合體識别受體DNA的靶序列(Target site),切斷受體DNA,并插入攜帶的供體DNA,形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1,一端帶有P7部分接頭Adapter 2的DNA,之後通過PCR加上Barcode以及接頭其餘部分,形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫。


圖4. Tn5轉座系統用于文庫構建

轉座系統具有快速“剪切、粘貼”、“複制、粘貼”的功能,已被創新應用于NGS領域,如ATAC-Seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing,利用高通量測序檢測轉座酶易接近的染色質),LIANTI(Linear Amplification via Transposon Insertion,通過轉座子的線性放大),單倍體分型,結構變異檢測等,不僅高效簡便,有效縮短NGS樣本建庫時間,實現規模化快速測序,提高測序分辨率,同時能夠被靈活改造,應用于更多的技術創新。

PCR擴增子建庫

擴增子建庫是指利用PCR反應在待測DNA片段兩端加上接頭的方法,原理相對比較簡單,隻需要兩輪PCR和兩步純化就可以得到目标區域的文庫(如圖5),其中第一步是含通用序列的引物與目标區域結合,第二步通過PCR反應連接測序接頭,使得構建的文庫可以用于上機測序(圖6)。

圖5.擴增子建庫的操作步驟

圖 6.擴增子建庫的兩次PCR反應

與其它建庫方法對比,擴增子建庫通過定制引物Panel完成文庫構建。在臨床背景下,擴增子建庫方法可以針對疾病目标基因進行捕獲,提高目标基因檢測的覆蓋度和測序深度,解釋臨床結果。相對于其他建庫方法來說,擴增子方法建庫可以通過單次測序反應檢測更多患者樣本,後期生信分析的任務大大減少,得到的數據更易于儲存和管理。

但是此方法的應用還受到一些限制:

1)PCR擴增子建庫應用于全外顯子或全基因組建庫時,由于設計出的引物不能完全擴增出所有的待測片段會導緻最終的文庫覆蓋率較低。

2)當擴增子之間有重疊時,為了避免重疊部分産生的短擴增子的優勢擴增的影響,需要有兩個或多個引物池,這樣就會導緻試驗流程複雜且增加成本。

3)多重PCR反應中容易出現引物二聚體的積累,引物二聚體由彼此雜交的引物分子組成,多重PCR反應中多對引物的存在大大提高了引物二聚體的形成機會,而引物二聚體的擴增會大量消耗引物本身和體系中其他的原料,甚至有抑制所需DNA序列擴增的效果。

平末端連接接頭建庫

平末端連接接頭的方法基于Ion Torrent平台。與Illumina平台類似,Ion Torrent平台的文庫構建目的也是在片段化好的DNA片段兩端加上特定接頭,該方法一般包括4個步驟:DNA樣本片段化、末端修複,連接adapter(PI和A/P1和X),選擇性回收DNA片段,文庫PCR富集,純化PCR産物(見圖7)。


       圖7.平末端接頭連接建庫方法流程圖(Ion Torrent平台)


在這裡需要注意的是:在Ion Torrent平台構建好的文庫通過油包水PCR種到測序柱子上,文庫中的X或A接頭是測序起始端,而P1接頭是是連到測序珠子的這一端。與Illumina通過采集熒光信号記錄記錄堿基序列的方法不同,Ion Torrent的測序是通過微環境中pH值短暫的下降被pH電極檢測到并且把測得的值傳給計算機記錄。



總結

綜上,NGS建庫可以按照接頭加入目的片段的不同分為5種,其中TA克隆連接接頭建庫法應用最廣泛,适用于絕大多數樣本建庫,是目前商業化建庫方式的主流;Swift法與TA克隆連接接頭法類似,操作上相對繁瑣,P5接頭和P7接頭是分兩步連接上的;轉座酶法隻需1h 40min即可完成文庫構建,可以節省大量的人力,但是在應用上隻适用于cDNA和全基因組等文庫的構建,且轉座酶本身具有偏好性,對後續的測序質量會有一定的影響;PCR擴增子建庫是捕獲建庫的一種,适用于臨床背景下靶向基因的研究,平末端連接接頭建庫适用于Ion Torrent平台,Ion Torrent市場占有率相對較低,所以此建庫方法應用範圍相對較少(見下表)。

表 NGS 5種建庫方法比較


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