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探秘細胞凋亡過程

——實用檢測方法盤點

>>>背景

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1:細胞凋亡與壞死過程

 細胞壞死(necrosis)是因病理而産生的被動死亡,如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導緻細胞。表現為細胞脹大、胞膜破裂、細胞内容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴重的局部炎症反應等。       

細胞凋亡與細胞壞死不同,細胞凋亡(Apoptosis)一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下通過細胞内基因及其産物的調控而發生的一種程序性細胞死亡過程, 是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。細胞凋亡途徑中各事件的發生是有時序性的,即各事件按先後順序依次發生,最終導緻凋亡小體的出現,細胞随後發生凋亡。細胞凋亡對胚胎發育及形态發生(morphogenesis)、組織内正常細胞群的穩定、機體的防禦和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起着重要作用,并具有潛在的治療意義。

表一:細胞凋亡與細胞死亡的區别

 

區别條目

細胞凋亡

細胞死亡

起因

生理或是病理性刺激因子誘發

病理性刺激因子誘發或是劇烈損傷

作用範圍

單個細胞

組織或是成群細胞

細胞形态

膜皺縮,體積變小

體積膨大,變性

細胞膜

保持完整直到形成凋亡小體

破損

細胞器

無明顯變化

膨大和破損

染色質

凝集并在核膜周圍呈現新月形帽狀結構分布

不凝集,呈現絮狀形态

凋亡小體

基因組DNA

規律性降解,呈片段化

随機降解,呈現彌散型

蛋白質合成

炎症反應

有,釋放細胞内含物

分子機制

與蛋白酶caspases基因家族有關

與蛋白激酶PIP3表達有關

 

表二:細胞凋亡的不同檢測方式

 

早期檢測

 PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

細胞内氧化還原狀态改變的檢測

細胞色素C的定位檢測 

線粒體膜電位變化的檢測

晚期檢測

TUNEL法檢測

LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測

端粒酶檢測


mRNA水平檢測 

Northern雜交檢測

RT-PCR跑膠檢測



 

>>>探秘細胞凋亡,抓重點、找方法

細胞處于不同的凋亡階段需要找到不同的特點,配以合适的檢測工具就能準确解讀細胞凋亡的密碼。凋亡的細胞具有不同的生物學特征,典型的特征包括:1)細胞膜PS(磷脂酰絲氨酸)外翻;2)線粒體膜電位喪失;3)細胞核濃縮和斷裂

>>>凋亡早期檢測

在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸(Phosphotidylserine, PS)位于細胞膜内側,但在早期凋亡的細胞中,PS由細胞膜的内側翻轉到細胞膜表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36 kDaCa2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力結合,通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。将 Annexin-V  PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

 

1558330025536637.jpg

2:Annexin-V 檢測早期凋亡原理示意圖

>>>線粒體膜電位變化的檢測

線粒體膜電位(△Ψm )的丢失導緻線粒體膜中線粒體通透性轉換孔的開放,細胞色素CCytochrome C)被釋放到細胞漿中,緻使Caspase被激活從而誘導細胞凋亡。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(△Ψm )的理想熒光探針,表現出電勢依賴性的積聚在線粒體内。正常線粒體内,JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物,聚合物發出強烈的紅色熒光;而在凋亡細胞中,線粒體跨膜電位去極化,JC-1從線粒體内釋放,濃度降低,逆轉為發射綠色熒光的單體形式。因此顔色的變化将直接反映出線粒體膜電位的變化。

圖片3.png

3:JC-1檢測熒光與流式結果示意圖(圖片源自科學網)

>>>凋亡晚期檢測

細胞凋亡晚期,染色體DNA雙鍊斷裂或單鍊斷裂而産生大量的粘性3’-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,将熒光素/酶标記的dUTP結合到DNA3’--OH末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端标記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL

1558330103306493.png 

4:TUNEL法檢測原理示意圖

>>>客戶使用數據展示

 Annexin-V檢測

圖片5.png 

(a-2, b-2) 100 μg/ml AuNCs@L-GSH 處理24h,(a-3, b-3) 100 μg/ml AuNCs@D-GSH 處理24h,(a-1, b-1) 無處理。

檢測試劑:Cat No. 40302 Annexin-V -FITC/PI檢測流式分析早期凋亡

JC-1檢測

圖片6.png 

上象限中顯示去極化細胞的百分比狀圖代表正常細胞,去極化細胞和壞死細胞的平均比例

檢測試劑:Cat No. 40705 JC-1檢測線粒體膜電位改變.

Tunel檢測

圖片7.png 

小鼠前脂肪細胞3T3-L凋亡檢測。第一行代表陰性對照,第二行代表陽性對照

檢測試劑:Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

 

圖片8.png 

石蠟包埋的腫瘤組織(取自裸鼠)

檢測試劑:Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

>>>已使用客戶發表文章引用

Annexin V

[1]. Zhang C, Li C, Liu Y, et al. Gold Nanoclusters‐Based Nanoprobes for Simultaneous Fluorescence Imaging and Targeted Photodynamic Therapy with Superior Penetration and Retention Behavior in Tumors[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(8): 1314-1325.IF =13.325

     [2] Zhang L, Wan SS, et al. An Adenosine Triphosphate-Responsive Autocatalytic Fenton Nanoparticle for Tumor Ablation with Self-Supplied H2O2 and Acceleration of Fe(III)/Fe(II) Conversion. Nano Lett. 2018 Nov 7.IF =12.08

[3]. Zhang, C., et al., Insights into the distinguishing stress-induced cytotoxicity of chiral gold nanoclusters and the relationship with GSTP1[J]. Theranostics, 2015. 5(2): p. 134-49.IF =8.537

[4]. Hou, W., et al., pH-Sensitive self-assembling nanoparticles for tumor near-infrared fluorescence imaging and chemo-photodynamic combination therapy[J]. Nanoscale, 2016. 8(1): p. 104-16.IF =7.233

[5].Liu, H., et al., Targeting heat-shock protein 90 with ganetespib for molecularly targeted therapy of gastric cancer[J]. Cell Death Dis, 2015. 6: p. e1595.IF =5.638

[6].Wu, Z., et al., LncRNA-N1LR Enhances Neuroprotection Against Ischemic Stroke Probably by Inhibiting p53 Phosphorylation[J]. Mol Neurobiol, 2016.IF =5.076

[7]. Zhang C, Wang K, Li C, et al. Stress-induced cytotoxicity of chiral Ag nanoclusters[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2(40): 6931-6938.IF =4.776

[8]. Liu X, Liu B, Gao S, et al. Glyco-decorated tobacco mosaic virus as a vector for cisplatin delivery[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2017, 5(11): 2078-2085.IF =4.776

[9].Ni, C., et al., A novel mutation in TRPV3 gene causes atypical familial Olmsted syndrome[J]. Sci Rep, 2016. 6: p. 21815.IF =4.122

[10].Aipire, A., et al., Glycyrrhiza uralensis water extract enhances dendritic cell maturation and antitumor efficacy of HPV dendritic cell-based vaccine[J]. Sci Rep, 2017. 7: p. 43796.IF =4.122

[11].Cui, D., et al., Regression of Gastric Cancer by Systemic Injection of RNA Nanoparticles Carrying both Ligand and siRNA[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 10726.IF =4.122

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JC-1 or JC-10

 

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[3]. Wu W B, Menon R, Xu Y Y, et al. Downregulation of peroxiredoxin-3 by hydrophobic bile acid induces mitochondrial dysfunction and cellular senescence in human trophoblasts[J]. Scientific reports, 2016, 6.IF =4.122

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[7].Chen P, Hu T, Liang Y, et al. Synergistic inhibition of autophagy and neddylation pathways as a novel therapeutic approach for targeting liver cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(11): 9002.IF =2.656

 

TUNEL

 

[1]. Zhang C, Li C, Liu Y, et al. Gold Nanoclusters‐Based Nanoprobes for Simultaneous Fluorescence Imaging and Targeted Photodynamic Therapy with Superior Penetration and Retention Behavior in Tumors[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(8): 1314-1325.IF =13.325

[2].Liu Q, Qian Y, Li P, et al. 131 I-Labeled Copper Sulfide-Loaded Microspheres to Treat Hepatic Tumors via Hepatic Artery Embolization[J]. Theranostics, 2018, 8(3):785-799.IF=8.537

[3]. Zhang C, Wang K, Li C, et al. Stress-induced cytotoxicity of chiral Ag nanoclusters[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2(40): 6931-6938.IF =4.776

[4]. Shi, G., et al., Sox9 facilitates proliferation, differentiation and lipogenesis in primary cultured human sebocytes. J Dermatol Sci, 2017. 85(1): p. 44-50.IF =3.675

[5]. Jiang, Y., et al., Phosphatidic Acid Improves Reprogramming to Pluripotency by Reducing Apoptosis. Stem Cells Dev, 2016. 25(1): p. 43-54.IF =3.315

 

>>>附上小編一些檢測實驗TIPS

AnnexinV/PI檢測

Q:Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動物細胞凋亡情況?

A:可以。因為Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)的結合,而PS不存在種屬間差異。

 

Q:使用Annexin V/ PI 試劑盒進行凋亡檢測,用含EDTA 的胰酶消化細胞對結果有影響嗎?

A:會。因為Annexin V Ca2+ 依賴的蛋白,EDTA會 螯合Ca2+從而影響Annexin VPS 的結合,進而影響實驗結果。

 

Q:如果細胞自帶GFP蛋白,請問哪種凋亡檢測試劑盒适用該細胞的凋亡檢測?

A:選用PE标記或者APC标記的Annexin V凋亡檢測試劑。

 

Q:對于來自血液的細胞樣品,為什麼去除血液中的血小闆?

A:因為血小闆中含有PS,其能與Annexin V結合進而幹擾實驗結果。

 

Q:Annexin -V 在實驗操作上應注意哪些事項?

A:由于Annexin -V染料上帶有熒光基團,在實驗操作上應盡量避光操作和孵育;為保證實驗結果的正确性應在染色後1h内上機檢測。

TUNEL檢測

Q:組織切片厚度多少比較合适?

A:組織切片過厚,會使得固定效果不理想,最好控制在10μm以内。

 

Q:除了多聚甲醛固定,可不可以使用甲醇固定?

A:使用乙醇或甲醇固定會導緻标記的效率較低。酸性固定液,也容易導緻假陽性的出現。建議采用新鮮配置的4%中性多聚甲醛固定液。

 

Q:如何避免出現非特異性熒光标記?

A:1)對于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細胞,例如平滑肌細胞,建議取細胞或組織後立即固定并且要充分固定,以阻止這些酶導緻假陽性。

(2)在進行末端标記的時候,保證細胞或組織表面保持濕潤,檢測反應液能很好地覆蓋樣品。

 

Q:Tunel檢測在實驗操作上有哪些注意事項?

A:熒光基團長期暴露在普通光照下,會發生嚴重淬滅,因此在實驗操作上應盡量避光操作和孵育。

 

熒光補償的調節

Q:光補償調節的原則?

A: 1)用于調節補償的樣本必須單染。

2)用來調節補償的熒光素必須與實驗用的熒光素一樣(例如不能用FITC調節EGFP的補償)。

2)橫平豎直:理論上X-Mean或者Y-Mean要相等(如圖所示),但在實際操作中,隻需要保證單染的細胞不跨區存在。

image.png 

Q:如何進行光補償的調節?

A:進行熒光補償的調節,需要設置幾組對照實驗。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例;

1)空白對照組:不進行任何标記的細胞,用于電壓的調節,調整前向散射和側向散射,得到清晰劃分的細胞群體。

2)凋亡誘導的單染組:陽性對照的細胞群體需要超過分析的細胞群體的10%,用于調節補償。

3)雙染實驗組:利用空白對照組和單染組調節好的參數進行實驗數據的獲得。

>>>相關産品

産品名稱

産品編号

規格

價格(元)

促銷價(元)

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40302ES20

20 T

480.00

366.00

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40302ES50

50 T

960.00

686.00

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40302ES60

100 T

1680.00

986.00

Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40303ES20

20 T

480.00

386.00

Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40303ES50

50 T

960.00

786.00

Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40303ES60

100 T

1680.00

1346.00

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40304ES20

20 T

518.00

386.00

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40304ES50

50 T

1120.00

786.00

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40304ES60

100 T

1960.00

1346.00

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40305ES20

20 T

518.00

386.00

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40305ES50

50 T

1120.00

786.00

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

40305ES60

100 T

1960.00

1346.00

Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

40310ES20

20 T

480.00

386.00

Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

40310ES50

50 T

960.00

786.00

Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

40310ES60

100 T

1680.00

1346.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC

40306ES20

20 T

1178.00

1178.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC

40306ES50

50 T

2680.00

2680.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC

40306ES60

100 T

4080.00

4080.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488

40307ES20

20 T

1250.00

1250.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488

40307ES50

50 T

3080.00

3080.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488

40307ES60

100 T

4800.00

4800.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640

40308ES20

20 T

1250.00

1250.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640

40308ES50

50 T

3080.00

3080.00

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640

40308ES60

100 T

4800.00

4800.00

 

HB20190605