Welcome to 头奖网址 為夢而年輕!

您好,歡迎來到上海翊聖生物科技有限公司官方網站!
400-6111-883
| EN
400-6111-883
新聞中心
首頁 > 新聞中心 > 技術資源更新
認識qPCR文章金标準——MIQE

image.png      
      qPCR實驗靈敏度非常高,一個條件的不同就可能導緻實驗結果發生改變。為了增加實驗可靠性、重複性,按照同一标準對實驗條件進行描述就很有必要了。MIQE就是這一國際化标準。


MIQE的由來:2009年,Stephen A等人發表文章《The MIQE Guidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》,文中規定了qPCR結果想要發表需要提供的最少信息,文章一經發表,就得到了大衆的認可,現已成為國際化标準。所以想要發表文章的小夥伴就需要先了解下MIQE内容。


       MIQE規定:文章投稿時需要同時提交一個清單。該清單分9個部分、85個參數。其中标記為“E”表示必須(essential),标記為“D”表示建議(desirable)。(點擊查看清單)


      RT-qPCR通常分為以下五個步驟:1. 樣本采集、處理和制備;2. 核酸質量控制;3. 反轉錄;4. qPCR;5. 數據分析。下面,我們看下每一步所需信息。



01
樣本采集、處理和制備



1.采集:來源是哪個物種、器官、組織。并對樣本進行簡要說明。例如:腫瘤樣本描述腫瘤細胞組成比例。


2.處理:提取RNA是用新鮮組織還是冰凍組織,如果冰凍,是如何冰凍的,凍了多長時間。


3.制備:樣本如何均質化的,樣品目标密度、生理狀态、遺傳複雜性如何,處理了多少生物量。



02
核酸的質量控制



1.提取:操作環境、試劑、耗材中有無RNase。


2.定量:用何種方法做定量,量是多少。一篇文章中需要用同一種方法來定量RNA。


3.gDNA去除:描述gDNA污染程度。RNA樣本是否經過DNase處理(包括DNase類型和反應條件)。


4.質量評估:質量評估方法和結果。推薦使用凝膠電泳或者微流控芯片rRNA分析。


5.雜質殘留:雜質殘留檢測結果。例如:通過稀釋樣本做反轉錄來檢測PCR抑制劑的存在,或者使用SPUD等抑制試驗。



03
  反轉錄



必須要詳細描述逆轉錄的方法和試劑。包括:
RNA模闆量,引物種類,酶的類型與數量,反應體系以及反應的時間和溫度。



04
qPCR



1.基因信息:

基因的數據庫登陸信息,目标核酸的結構(如RNA的莖環結構)。目的基因的長度。


2.引物信息:序列和濃度,結合位點。


3.染料或探針:染料種類、探針序列等。


4.實驗設計:内參基因的選擇、複孔數、陰性陽性對照。


5.反應體系及反應條件:聚合酶的名稱和濃度,模闆量,緩沖液化學組成,反應體系總量,反應溫度及循環數。


6.儀器耗材:塑料耗材的透明度如何,反應容器為單一管、帶還是闆,制造商是哪家。當使用闆時,還需提供闆的密封方法。



05
數據分析



數據分析包括審查原始數據,評估質量和可靠性,以及結果分析。在做數據分析時需要提供如下信息:


1.标準曲線:對每一對引物制作标準曲線來分析擴增效率。


2.實驗組和對照組的Cq值


3.數據計算方法和歸一化方法


4.數據重複性如何


5.統計方法和計算軟件



06
術語統一



1.qPCR指的是實時熒光定量PCR,RT-qPCR指反轉錄qPCR;


2.用于歸一化的基因叫做參考基因,而不是管家基因;


3.TaqMan 探針應該被稱為水解探針;


4.FRET是熒光共振能量轉移探針(fluorescence resonance energy transfer probe)的總稱,LightCycler-type探針應稱為雙雜交探針。


5.不用單詞“quantitation”,而使用“quantification” ;


6.描述用于量化的PCR循環數不用Ct、Cp及TOP等單詞,建議使用“Cq”來描述。


結語

MIQE指南提供了發表被認可的 RT-qPCR 實驗結果所需考慮的所有參數,本篇文章僅羅列了其中的關鍵條目,作為了解MIQE的引子。鼓勵大家深度閱讀原文,以期獲得理想的實驗結果。


查看原文,。