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NGS文庫質檢方法與注意事項

——文庫大小、質量、污染物評測

   
   文庫的質量對于高通量測序(NGS)産出的數據質量至關重要。過低估計文庫的質量,導緻Clusters或多重模闆太多,數據質量不高;過高估計文庫的質量,導緻數據讀取量少,基因組覆蓋率低,所以低估或者高估文庫質量都會影響測序效果。

 那麼,如何判斷伱做出來的文庫是可以用于上機測序的,而不是白費力氣建了個沒用的文庫?或者更糟糕,構建出的文庫可以上機測序,但是得到了一堆沒有用的數據?

  不要擔心,如果伱的實驗設計精良,伱隻需要做3步簡單的質控就可以判斷文庫是否合格。

  Bioanalyzer——文庫長度檢測

 qPCR/Qubit——文庫精确定量

Nanodrop——文庫污染物檢測

1. 文庫長度檢測

文庫長度檢測是文庫質控的關鍵步驟。測序上機時,要求文庫等摩爾上樣(否則可能造成不同文庫簇生成密度不同,而影響測序質量),文庫的平均長度是計算文庫摩爾數的要素之一。

文庫摩爾數(pmol)≈ 文庫質量(ng)/ [0.66×文庫平均長度(bp]

Agilent Bioanalyzer是進行文庫長度檢測最常用的儀器,它基于微控流技術對樣本進行分離檢測。根據加樣要求,在DNA芯片中加入Ladder、Marker、Gel、Dye以及Sample,當給芯片加入電壓時,樣品便在芯片上的顯微蝕刻管道中進行毛細管電泳,在樣本流動過程中,不同DNA片段根據其大小被分離。同時凝膠-染料基質中的熒光染料可嵌入DNA雙鍊,通過激光激發熒光,使其被儀器檢測到,儀器依據收集到的熒光信号強度對樣本粗略定量。

一般情況下,好的文庫應該呈現出單一的、圓滑的峰,且接近正态分布,長度範圍在150-700bp之間。如下圖為使用100 ng E.coli gDNA建庫,接頭連接後進行雙輪分選(0.6×/0.2×和0.55×/0.15×)的檢測結果。

12

   有時,文庫也可能在150-700bp的範圍之外出現雜峰。不同的雜峰大小與峰形可參照以下情況進行分析和實驗改進。

1) 150bp以下出現雜峰

這種情況可認為是文庫擴增時的引物二聚體殘留或接頭殘留導緻的,可以通過稍微降低磁珠使用比例重新純化文庫解決。注意,磁珠使用過程中的移液操作,切勿擾動磁珠。

2)在700bp以上出現雜峰

    這種情況可認為是文庫擴增循環數過高,出現文庫過度擴增自我交聯導緻的,可以通過文庫重新分選解決。

3)整個文庫呈現大小不對稱

   這種情況可認為文庫分選操作不良或Input DNA片段化不徹底導緻的,可以通過重新進行文庫分選或者重新構建文庫解決。

2. 文庫濃度檢測

文庫質量也是計算文庫上機摩爾數的要素。常規使用qPCR法和熒光計法(以Qubit®常用)。

1qPCR

qPCR法使用特異性引物僅定量樣品中兩端接頭連接完整的文庫(即可測序的文庫),可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的幹擾,是目前業内進行文庫定量的金标準。使用qPCR法時,需要以不同濃度的已知長度的DNA片段(常為452bp)作為标準品進行标曲制作,進而進行文庫定量。

由于标準品與文庫的實際長度可能不同,因此計算時,需要對文庫質量進行校正。

原始文庫濃度(nM= [452 bp /文庫平均長度(bp] × 稀釋文庫的濃度(pM× 稀釋倍數/1000

一般情況下,理想的文庫濃度應在10-100nM之間。如果文庫測定結果在100nM以上,表明文庫的PCR循環數過高,這可能會增加測序數據中的Duplicate rate,此時可以通過減低1PCR循環數來獲得10-100nM之間的文庫。

為了獲得精确的定量結果,在使用qPCR方式進行文庫定量時,建議遵循以下原則:

Ø  等量分裝qPCR MixDNA标準品,避免模闆污染和反複凍融的影響

Ø  在進行qPCR之前,将反應體系配制區和模闆制備區進行物理隔離,并定時使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對各實驗區域進行擦拭清理。

Ø  待測樣本做梯度稀釋,并且同時做3個平行重複

Ø  檢查梯度稀釋液以及平行樣本具有一緻性的可重複的測定值

Ø  檢查确定待測文庫Ct在标準曲線以内時,使用标準曲線計算文庫濃度

2)熒光計法(Qubit®, Picogreen

Qubit®是核酸和蛋白定量熒光儀,采用熒光染料檢測特定目标分子的濃度,能夠對DNARNA進行精準定量。Picogreen是一種極為靈敏的熒光核酸染料,其僅在與DNA雙鍊結合後才發出熒光,且所産生的熒光與DNA濃度呈正比,是定量DNA文庫的最常用染料。

https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/Laboratory%20Instruments/Images/1014/sho-qubit-instrument.jpg     https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/ba/PicoGreen_%28topological_formula%29.png/651px-PicoGreen_%28topological_formula%29.png

由于染料與DNA雙鍊結合,但無法有效區分文庫雙鍊和其他不完整雙鍊結構(如單端連接接頭産物或未連接接頭産物),所以相對qPCR法定量文庫來說,Qubit®方法的精确度稍弱一些,但是Qubit®出衆的簡便性、靈敏度以及低成本使得Qubit®成為測序實驗室必備的儀器之一。此外,Input DNA由于沒有添加接頭,是無法使用qPCR方式定量的,此時Qubit®方法相對其他如Nanodrop等方法來說,是最為精确的方法。

使用Qubit®熒光計方法得到的文庫濃度以ng/μL為單位,而測序上機文庫以nMnmol/L)為單位,因此測定值需要根據以下公式進行換算:

文庫摩爾數(nM)≈ 文庫質量(ng/μL)×106/[660×文庫平均長度(bp]

3. 文庫污染物檢測

Nanodrop是檢測樣本污染物最快的方法之一,能夠在包括紫外及可見光區域在内的光譜範圍内檢測污染物的吸光度信号,核酸污染物的常用參考标準是A260/280A260/230。

理想文庫的标準是A260/280>1.8,A260/230>2.0,不在該範圍時,建議重新進行文庫純化或者重新建庫,否則,可能造成文庫簇生成量少,測序數據質量差。

 

需要注意,不要使用Nanodrop做建庫過程中的DNARNA定量!

4. 相關産品

 

産品名稱          

産品編号

規格

價格(元)

Hieff NGSTM MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina

12200ES08

8 libraries

2456.00

12200ES24

24 libraries

6486.00

12200ES96

96 libraries

23567.00

Hieff NGSTM DNA selection BeadsSuperior AMPure XP alternative

12601ES03

1 mL

296.00

12601ES08

5 mL

986.00

12601ES56

60 mL

6286.00

12601ES75

450 mL

26186.00

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

12640ES60

100 T

686.00

12640ES76

500 T

2696.00

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, qPCR Master Mix

12302ES05

500 T

1526.00

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, DNA Standard (1-6)

12307ES09

6×96 μL

2126.00

 

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